刺客信条回归并获得后续冠军几乎是不可避免的。凭借熟悉的角色、在过去和现在之间来回切换的持续叙事装置以及需要消化的新情节，刺客信条2极大地改进了游戏玩法，从而增加了跨越新时代的更广阔的剧情故事和世界去探索。

主要剧情继续跟随戴斯蒙德·迈尔斯，只是这一次不是将阿泰尔生命中的关键时刻拼凑起来，而是这些基因记忆落入了戴斯蒙德的另一位祖先，埃齐奥·奥迪托雷·达·佛罗伦萨，我们这次跟随他。从游戏一开始，刺客信条2就拥有一个更加充满活力的世界，故事发生在 15和16世纪意大利文艺复兴的鼎盛时期，而圣殿骑士和刺客之间的持续不和笼罩着大片地区。

在刺客信条2的剧情故事之后，我们的故事开始于被刺客露西·斯蒂尔曼从监禁中解救出来的戴斯蒙德·迈尔斯，你可能还记得，他在前一场比赛中被揭露为卧底鼹鼠。她带他去了一个偏远的安全屋，在那里他会见了她的团队，包括历史学家和分析师肖恩·黑斯廷斯以及技术人员丽贝卡·克兰。利用露西窃取的计划，该组织构建了自己的Animus版本，称为“宝贝”，他们打算用它来通过所谓的“流血效应”将戴斯蒙德训练为刺客。

流血效果允许用户立即学习他们祖先的所有技能，省去所有耗时的训练。戴斯蒙德被指派调查他祖先埃齐奥的记忆，从他在15世纪后期出生于一个富裕的佛罗伦萨家庭开始。一路上，埃齐奥遇到了真实的历史人物，包括尼可罗·马基雅维利和罗德里戈·博吉亚；后者后来被称为教皇亚历山大六世。

然后故事在意大利跳过了几年，埃齐奥是一个鲁莽的人，生活在文艺复兴时期的中心。在他的父亲和兄弟因被腐败的地方法官诬陷叛国罪而被错误地绞死之后，埃齐奥杀死了那个地方法官并逃到蒙特里久尼与他的母亲和妹妹在一起。在那里，他的叔叔马里奥透露他和他的父亲在刺客组织中服役，并同意训练埃齐奥进行隐身和战斗。